RNA核酸抽出及び精製キット規格

特長：

1.特異性：すべての製品に使用されるプライマーは詳細な生物情報学的分析を経て、ジェンバンク及び独自に巨大なデータベースの比較を構築し、使用するプライマーのすべてが種属或いは血清型特異的遺伝子配列セグメントであることを確保し、細菌種属及び血清型に対する特異的検査を実現でき、特異性はすべて達成できる佳い 。

2. 再現性：このシリーズのすべての製品は大量の実験菌株の検証を経て、再現性は佳い 。

3. 感度：このシリーズ製品は検出菌に対する高感度検査を実現でき、サンプル中の細菌の濃度が103cfu/ml時、それに対する直接検査を実現することができて、面倒な増菌過程を必要としません。

4. 実用性：検査範囲が広く、人体への危害が比較的に深刻なものをカバーしている17呼吸器及び腸管病原菌を栽培し、臨床サンプル及びその他の環境サンプリングに対する迅速な検査を実現することができ、検査過程全体は3-4時間です。

5. 優位1：シーケンスリソースが豊富で、ジェンバンク公表された配列のほか、同社は大量の菌株の配列解読を行い、選択されたプライマーが良好な保存性と特異性を持つことを理論的に保証した。

6. 優位2：このシリーズのキットはすべて大量の保存性と特異性の実験検証を経て、会社が持っている豊富な菌種資源によって、各検査キットはすべて経過した20余種標準菌株と臨床菌株の保存性検証及び40余剰種の近縁標準菌株と臨床菌株の特異性検証により、使用過程においていかなる偽陽性及び偽陰性報告結果も現れないことを確保する。

抽出手順：

1.マイナス80冷蔵庫からサンプルを取り出し、氷の上に置いてゆっくり解凍する、（4度まで予冷遠心分離機）

2.解凍後（赤色）、200μlクロロホルム（クロロホルム体積をTrizol体積の1/5とする）を添加し、激しく振動（乳白色赤色）し、氷上に10分間静置する。（クロロホルムは有機溶媒であり、有機相と無機相を迅速に分離するのに有効である。有機相では主にフェノールと蛋白質が結合し、それによって蛋白質とRNAが離脱し、RNAが水相に入る。）

3.予冷遠心機に置き、遠心（4度、12000 rpm、15 min）し、遠心した後、明らかに3層に分けられた（上層の無色透明水相はRNA層、中間の薄い乳白色はDNA層、下層は赤色は蛋白層）。

4.ゆっくりと上清を吸い上げ、約400μl（むしろ少なく吸っても、多く吸い取らない）、別の新しい1.5 ml RNase-free EPチューブに入れ、等体積のイソプロパノールを加え、上下を逆に混ぜ、常温で15分間静置する。

5.遠心分離（4度、12000 rpm、15 min）、白色沈殿が見られる（細胞が少なく沈殿が見られない場合があり、負の20時間または負の82時間を置いてから後のステップに進むことができる）

6.上清を捨て、各管に950 ulの75%エタノールを加え、上下を逆に混合する（銃で吹き付けて混合しないように注意し、RNAが溶解する）。

7.遠心分離（4度、12000 rpm、10 min）、底部に明らかに白色沈殿が見られた。

8.遠心分離後、上澄みを捨て、遠心分離機に入れて再び瞬離し、10μlのピペットで残留液体を洗浄し、蓋を開けて乾かす（約5 min）。

9.各サンプルは沈殿サイズに応じて適量のDEPC水（一般的に20 ~ 30μl、沈殿が見えない場合があり、10μlのDEPC水を加えて溶解することができる）を添加し、RNAを吹き付けて溶解し、11階酵素スケール測定濃度、OD値（260/280=1.8-2.0）標識、負80保存した。

備考：好中球抽出の場合RNAは細胞数が2 x 106/サンプルより大きいことを提案し、

備考：操作中にマスクを着用する。

PCR反応五要素：
参加するPCR反応の物質は主に5種類のプライマー、酵素、dNTP、テンプレートとMg 2+
プライマー:プライマーはPCR特異的反応の鍵であり、PCR生成物の特異性はプライマーとテンプレートDNAの相補性の程度に依存する。理論的には、テンプレートDNA配列を知っていれば、その設計によって相補的なオリゴヌクレオチド鎖をプライマーとすることができ、PCRを利用することでテンプレートDNAを体外で大量に増幅することができる。
設計プライマーは次の原則に従う必要があります。
①プライマー長さ：15〜30 bp、常用は20 bp程度。
②プライマー増幅幅幅幅：200〜500 bpが好ましく、特定の条件下で10 kbまで増幅できる断片。
③プライマー塩基：G+C含有量は40-60%が適当で、G+Cが少なすぎて増幅効果がよくなく、G+Cが多すぎて非特異ストリップが現れやすい。ATGCはランダムに分布し、5つ以上のプリンまたはピリミジンヌクレオチドの配列を避ける。
④プライマー内部に二次構造が出現することを避け、2本のプライマー間の相補、特に3’端の相補を避け、そうしないとプライマー二量体が形成され、非特異的な増幅ストリップが発生する。
⑤プライマー3’末端の塩基、特に末端及び逆数の塩基は、末端塩基の不整合によるPCR失敗を避けるために、ペアリングを厳格に要求しなければならない。
⑥プライマー中に適切な酵素切断部位があるか、または加えることができ、増幅された標的配列に適切な酵素切断部位があり、これは酵素切断分析または分子クローニングに非常に有利である。
⑦プライマーの特異性：プライマーは核酸配列データベースの他の配列と明らかな相同性がないこと。

注意事項:

1.キットの冷蔵環境からの取り出しは室温平衡15-30分後に使用可能であり、酵素標準バッグはプレートに開封された後、使い終わっていなければ、スラットは密封袋に入れて保存しなければならない。濃洗浄液は結晶析出がある可能性があり、希釈時に水浴中で加温して溶解を助けることができ、洗浄時に結果に影響しない。

2.各ステップのサンプリングはサンプリング器を使用し、試験誤差を避けるために常に正確性を校正しなければならない。1回のサンプリング時間は5分以内に制御され、標本数が多い場合は、排銃によるサンプリングを推奨します。

3.測定ごとに標準曲線を作成してください，複素孔を作る。サンプル中の測定対象物質の含有量が高すぎる（サンプルOD値は標準品穴diの穴のOD値より大きい）、まずサンプル希釈液で一定倍数（n倍）希釈してから測定して、計算する時また総希釈倍率（×n×5）。

4.カバーフィルムは、交差汚染を回避するために使い捨てに限られている。

5.基質は光を避けて保存してください。

6.厳格に説明書の操作に従って行い、試験結果の判定は酵素標準器の示度を基準としなければならない。

7.すべてのサンプル、洗浄液及び各種廃棄物は伝染物によって処理しなければならない。

8.本試薬の異なるロット番号成分は混合してはならない。

9.期限切れ製品は使用できません。

10.英語の説明書と異なる場合は、英語の説明書に準じる。

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