MTS細胞増殖と細胞毒性測定キット

日文名称：MTS細胞増殖と細胞毒性測定キット

英語名：MTS Cell Proliferation And Cytoxicity Detection Kit

製品仕様：500回
製品番号：BJ-01 X 6321

MTSは新規なメチルアミン化合物であり、MTTと同じテトラゾール窒素誘導体である。MTSは生きた細胞内のミトコンドリア脱水素酵素によって分解されて茶色の水溶性のメチルアミンを産生し、メチルアミンのスペクトル吸収を測定することによって、さらに細胞の増殖状況を測定することができる。

細胞培養操作規程：
一.培地及び培養凍結保存条件の準備：
1）F−12 K培地の準備、良質の子牛血清、10%、2対抵抗、1%。
2）培養条件：気相：空気、95%、二酸化炭素、5%。温度：37℃、培養箱の湿度は70〜80%である。
3）凍結保存液：90%血清、10%DMSO、現用現用配合。
二.細胞処理：
1）蘇生細胞：1 mLの細胞懸濁液を含む凍結保存管を迅速に37℃の水浴（水面は凍結保存管の蓋部より低い）に入れて揺動解凍し、事前に準備した4 mL培地を含む15 mlの遠心管に移して均一に混合する。1000 RPM条件下で4分間遠心分離し、上清を捨て、1 mL培地を加えた後、均等に吹き付けた。その後、すべての細胞懸濁液を5 mlの培地を含む培養瓶に移して一晩培養した。翌日に液を交換し、細胞密度を検査した。
2）細胞継代：細胞密度が80〜90%に達すると、継代培養を行うことができる。

細胞培養方法：
1、細胞継代：細胞密度が80-90%に達すると継代できる
①培養上清を捨て、PBSまたは生理食塩水で1〜2回洗浄する。
②2 ml 0.25%（T 25本）を加え、瓶または皿全体を覆い、蓋をして培養箱に入れて消化させる、
③1-2 min後、顕微鏡下で細胞を観察し、大部分の細胞が収縮し、少量の細胞が脱落した場合、軽く吹きつけて消化状況を確認した後、＊培地に加えて消化を停止する。細胞が壁にくっついたまま、培養箱に戻して軽く吹き付けることができるまで消化を続け、
④細胞懸濁液1000 RPM前後の条件下で4 min遠心分離し、上清を捨てる、
⑤新鮮な培地を再懸濁した後、培養瓶または皿に加え、T 25培養瓶に6-8 ml培地を加えた、
⑥懸濁細胞は直接遠心分離して収集し、細胞が沈殿して再懸濁した後、新培養瓶に分けた。
2、細胞回復：
①凍結保存管を37℃の温水で急速に揺らして溶かし、時間は1 min程度で、4-5 mlの培地を加えてよく混ぜる。
②1000 RPM前後の条件下で4 min遠心分離し、清を捨て、1-2 mlの培地を加えて均等に吹き、細胞懸濁液を培養瓶に加え、適量の培地を補充する。
3、細胞凍結保存：細胞成長状態が良好な時に細胞凍結保存保存を行う
①培養上清を捨て、PBSまたは生理食塩水で1-2回洗浄し、1 mL 0.25%（T 25本）を添加する
②1-2 min後、顕微鏡下で細胞を観察し、大部分の細胞は収縮し、少量の細胞が脱落し、軽く吹きつけて消化状況を確認した後、＊培地に加えて消化を停止する、
③細胞懸濁液1000 RPM前後の条件下で4 min遠心分離し、上清を捨て、1 mlの凍結保存液を加えて細胞を再懸濁する、
④凍結貯蔵管をプログラム冷却箱に入れ、−80℃の冷蔵庫に入れ、4時間後に凍結貯蔵管を液体窒素タンクに移して貯蔵する。

TM 3（マウス精巣間質細胞）5×106 cells/瓶×2

TSCCa（ヒト舌鱗癌細胞）5×106 cells/ボトル×2

U-2 OS（ヒト骨肉腫細胞）5×106 cells/ボトル×2

U 251（ヒト膠腫細胞）5×106 cells/ボトル×2

U-87 MG（ヒト神経膠腫細胞）5×106 cells/ボトル×2

U-937（ヒト組織細胞リンパ腫細胞）5×106 cells/ボトル×2

V 79（ハムスター肺細胞）5×106 cells/ボトル×2

VCaP（ヒト前立腺癌細胞）5×106 cells/ボトル×2

Vero（アフリカニホンザル腎細胞）5×106 cells/ボトル×2

WI-38（ヒト胚肺細胞）5×106 cells/ボトル×2

WISH（ヒト羊膜細胞）5×106 cells/ボトル×2

Y 1（Y-1）（マウス副腎皮質細胞）5×106 cells/ボトル×2

YAC-1（マウスリンパ腫細胞）5×106 cells/ボトル×2

ZR-75-1（ヒト乳がん細胞）5×106 cells/ボトル×2

ZR-75-30（ヒト乳がん細胞）5×106 cells/ボトル×2

16 HBE（ヒト気管支上皮様細胞）5×106 cells/ボトル×2

801-D（ヒト巨細胞性肺癌細胞）5×106 cells/ボトル×2

A 2（ヒト腺様嚢胞性癌細胞）5×106 cells/瓶×2

A-427（ヒト肺癌細胞）5×106 cells/ボトル×2

A-498（ヒト腎癌細胞）5×106 cells/ボトル×2

A 875（ヒトメラノーマ細胞）5×106 cells/ボトル×2

肺α/β加水分解酵素タンパク質3抗体

アデノシン三リン酸結合カセット輸送タンパク質Fサブユニット3抗体

アデノシン三リン酸結合カセット輸送タンパク質Aサブユニット5抗体

ADCK 1タンパク質抗体

アシル結合ドメイン蛋白4抗体

α/β加水分解酵素4抗体

ADCK 2タンパク質抗体

アセトアルデヒド脱水素酵素16家庭A 1抗体

接着分子IgG様ドメインタンパク質3抗体

エタノール脱水素酵素1抗体

δアミノアセチルプロピオン酸脱水酵素抗体

筋側索硬化症関連蛋白4抗体

α2マクログロブリン抗体

ACCSL蛋白抗体

メチル胎児蛋白抗体

βアミロイド前駆体蛋白結合蛋白3抗体

スターアクチン抗体

系統性エリテマトーデス関連蛋白TREX 1抗体

リン酸化系統性エリテマトーデス先関タンパク質TREX 1抗体

リン酸化系エリテマトーデス関連タンパク質TREX 1抗体

MTS細胞増殖と細胞毒性測定キット頭関連蛋白複合体AP-2μ鎖1抗体

リン酸化リンカー関連タンパク質複合体AP−2μ鎖1抗体

膜ブロッキング蛋白質7抗体

操作規程
1、96ウェルプレートに細胞100μL/ウェルを添加し、通常、細胞増殖試験はウェルごとに100マイクロリットル2000個の細胞を添加し、細胞毒性試験はウェルごとに100マイクロリットル5000～10000個の細胞を添加する（具体的なウェルごとに使用する細胞の数は、細胞の大きさ、細胞増殖速度の速さなどによって決定する必要がある）。37℃の5%CO 2細胞培養箱で24時間培養した。
2、.0〜10μLの被験化合物を適切な濃度で添加した。
3、96ウェルプレートを37℃、5%CO 2空気及び100%湿度を含む細胞培養箱中で適切な時間インキュベートする。
4、5×MTTを希釈液で1×MTT溶液に希釈する。
5、1ウェル当たり50μL 1×MTT溶液を加え、37℃で4時間インキュベートし、MTTをメチルアミンに還元した。
6、上澄み液を吸引し、穴ごとに150μL DMSOを加えてメチルアミンを溶解させ、平板ロッカで均等に振る。
7、酵素スケール器は570 nm波長で穴ごとの光密度を検出する（例えば570 nmフィルタなし、560〜600 nmフィルタを使用できる）。
8、結果分析
a、細胞の生存率：各試験孔のOD値から本底OD値（*培地にMTT、細胞なし）または空白薬物孔OD値（*培地に被験薬の異なる希釈度にMTT、細胞なし）を減算し、各繰り返し孔のOD値は平均数±SDを取る。細胞の生存率はT/C%で示し、Tは投与細胞のOD値、Cは対照細胞のOD値である。細胞生存率%=（投与細胞OD/対照細胞OD）×100
b、T/C＝50%時の薬物濃度（IC 50）及びT/C＝10%時の薬物濃度（IC 90）を求める