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メール
3004965510@qq.com
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電話番号
15000017673
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アドレス
上海松江区
上海邦景実業有限公司
概要
MTT検査キット会社が販売している製品：PC-3 M（ヒト前立腺癌細胞）5#215;106 cells/ボトル#215;2-295（ヒトXG悪性膠腫細胞）5#215;106 cells/ボトル#215;2 SMC-1（ヒト胸膜腫細胞）5#215;106 cells/ボトル#215;2 SW 1116（ヒト結腸腺癌細胞）5#215;106 cells/ボトル#215;2-13（ヒト食道癌細胞）5#215;106 cells/ボトル#215;2
製品詳細
製品パラメータ：
| 中国語の名前 | 英語名 | 製品仕様 | 製品番号 |
| MTT検出キット | MTTアッセイキット | 500回 | BJ-01X6322 型 |
MTTは細胞成長の検出に広く用いられており、その原理はMTTは生細胞ミトコンドリア内の脱水素酵素によって還元されて深紫色のformazan結晶を生成することができ、死細胞はこの活性がない。濃い紫色のformazan結晶が溶解された後、490 nm波長の光吸収を測定することによりその濃度を測定することができ、これにより細胞の活力、細胞増殖が盛んであればあるほど吸光度が高くなると推測され、細胞毒性が大きいほど、吸光度は低くなる。
商品の詳細：
| 製品特徴： 1.*のFormazan溶解液を用いて、formazanを十分に溶解でき、誤差を減らすことができる。 2.背景が低く、感度が高く、線形範囲が広く、再現性が良い。 3.本製品は十分に500回（5個の96ウェル細胞培養プレート）のマイクロウェルプレート検査である。 4.生物活性因子活性検査、抗腫瘍薬物スクリーニング、細胞毒性試験、腫瘍感受性測定などに用いることができる。 貯蔵条件：低温輸送、-20℃保存（ただし溶液Bは常温輸送と保存も可能）、有効期間は1年間。 使用方法： 以下の操作は細胞毒性を検出する試験であり、その他の応用はこれと類似またはより簡単であり（例えば成長曲線試験）、操作手順はこれを基礎に少し修正すればよいので、詳しくは述べない。 一、接種細胞 1.通常の消化法に従って、合流した単層細胞を消化し、血清を含む培地に収集する。 2.200 gを5分間遠心分離して細胞沈殿を収集した。 3.培地再懸濁細胞を用いて沈殿させ、単細胞懸濁液を調製し、計数した。 4.細胞を2.5×103個/mL〜5×10個/mLの間に希釈する（細胞の成長速度によって決定する必要がある）、成長数度が分からない場合、一般的に1×10個/mLに希釈することができる。 5.十分な量の細胞懸濁液をペトリ皿に移す（排銃によるサンプリングを容易にする）。96ウェルプレートのMTT検出には約20 mLの細胞懸濁液が必要である。 6.96ウェルプレートで除した2〜11列目の各ウェルの中央に、200μL細胞懸濁液（正常細胞に）をガンで加えた。腫瘍細胞であれば、100μL腫瘍細胞懸濁液と100μL培地（総体積200μL）を添加した。注意：必ず細胞を穴の真ん中に入れなければならない。そうしないと、細胞は穴の隅に集まり、試験に影響を与える。 7.96ウェルプレートで除した第1および第12の各ウェルに、細胞懸濁液などの体積の培地をガンで加えた。第1列の各ウェルは+培地-細胞+MTT対照（OD時調ゼロ測定用）として作用し、第12列の培地添加の作用は第11列の反応に対するエッジ効果の影響を減らすことである。 8.従来の細胞培養方法に従って37℃と5%CO 2条件下で1〜3日間インキュベートし、細胞を指数成長期に入れた。 二、薬物処理 9.培地を用いて薬物を8つの測定待ち濃度に希釈し（測定待ち濃度が分からない場合は、予備試験により確定する必要がある）、一般的な薬物は3枚の平行板を作る必要がある。 10.第2〜第11列（計10列）の各ウェル中の培地（細胞に触れないこと）を除去し、第1列と第12列の各ウェル中の培地を保持する。 11.200μLの新鮮培地を、第2および第11列（計2列）の各ウェルに添加し、これらのウェルを+培地+細胞-薬物の対照とする。 12.第3〜第10列（計8列）の各ウェルに8つの濃度勾配の測定対象薬物を添加し、各列に1つの濃度の薬物を添加する。 13.96ウェルプレートを37℃と5%CO 2条件下で一定の時間インキュベートし続ける通常の方法で、この時間は薬物が細胞を処理する時間であり、ユーザー自身が決定する。 14.処理終了後、2〜11列目（全10列、すべて細胞を含む）のすべてのウェル中の培地を除去し、100μL新鮮培地を加えた。 15.細胞数を2〜3倍に増幅するための毎日の交換培養（細胞によって所要時間が異なる）。 三、生存細胞数 16.成長末期に、第1〜第11列の各ウェル中の培地を除去した後、100μLの新鮮培地と10μL溶液A（MTT成分を含む）を加え、96ウェルプレートを錫箔で包み、37℃と5%CO 2条件下で4〜8時間培養を続けた。注意：溶液Aは低温で凝固するので、使用前に室温で放置するか、20-25℃ですべて溶解するまで水浴し、よく振ってから使用してください。MTTは発がん性があり、手袋を持って操作しなければならない。 17.細孔内の培地（溶液Aを含む）を注意深く廃棄する。培地は光吸収に影響を与える可能性があるので、できるだけ除去することが望ましい。 18.1ウェル当たり100μL溶液Bを添加し、揺動床上で10分間低速振動させ、MTTで形成されたformazan結晶体を十分に溶解させた。 19.生成物が不安定であるため、直ちに酵素結合免疫検出器上で490 nmを選択して吸光度を測定する必要がある。 注意：第1列の各ウェル（＋培地−細胞＋MTT対照）を用いてゼロに調整する。 20.同じ処理の繰り返しの平均値をカウントする。 21.薬物濃度を横軸とし、吸光度を縦軸として曲線を描く。各処理吸光度の絶対値の差が大きいため、一般的には成長抑制率（薬物を加えない第2および第11列の各ウェルデータの平均数を100%とする）に変換する必要があり、これによりIC 50を算出し、各種薬物処理効果の比較に用いるのに便利である。注意：成長曲線を測定する場合は、時間を横軸とします。正常成長曲線は一般的にS型を呈し、促進作用がある場合は傾きが大きくなる。 |
実験報告：
一、分離と育成：
1、無菌条件下で、1-3 d齢SDラット心房組織を取り出し、その後PBSでこの組織塊を2回洗浄し、最後に組織を1 mm 3程度の大きさに切断した、
2、組織塊に4 mLの酵素消化液（0.1%と0.1%I型コラーゲン）を添加し、10 s懸濁し、37℃の条件下で10 min消化し、その後スポイトで吹き付けて単細胞懸濁液を作成し、自然沈殿し、上清を収集し、10%FBS含有培地で消化を終了した後、4℃で放置する。
3、残りの組織はさらに3～4 mLの酵素消化液を加え、10 s懸濁し、37℃で10分間消化した後、上述の方法で上澄みを収集し、消化を終了した後、4℃で放置し、このステップを2-3回繰り返し、組織*が消化されるまで、
4、200目ステンレススクリーンで細胞消化液を濾過し、1200 r/minで10 min遠心分離し、上清を捨て、沈殿細胞を10%FBS DMEM/F 12含有培地で混合懸濁し、25 cm 2培養瓶に接種し、37℃、5%CO 2培養箱に放置して培養する。
5、差速壁貼付1 h後、培地を吸引し、実験の必要に応じて6ウェルプレートに接種して培養を継続する、
二、免疫蛍光鑑定：
1、心房筋細胞の成長を80%融合まで待っている時、培地を捨て、培養したPBSで細胞を2回洗浄し、毎回10分間、その後4%パラホルムアルデヒドで室温条件下で細胞を15分間固定する、
2、PBSで細胞を2回洗浄し、毎回10分間、その後4℃の条件下で、0.1%TritonX-100で15分間膜を透過した、
3、PBSで細胞を2回洗浄し、毎回10 min、それから室温条件下で、4%BSAで細胞を30 min閉鎖する、
4、α-actin一抗を1：100の割合で希釈し、それを4℃の冷蔵庫に入れて細胞を一晩インキュベートする、
5、PBS細胞を3回洗浄し、毎回10 min、1：150の割合で抗α-actinの二抗を希釈し、37℃条件下で1時間放置する、
6、PBSで3回洗浄し、毎回10分間、最後に逆さ蛍光顕微鏡下で画像を観察し、写真を撮る。
培養操作手順：
1.カバー片ピンセットでカバーガラス片を75%エタノールから取り出し、無菌シルク布できれいに拭き、ガーゼを使わないでください。
2.カバーガラスを6穴の培養プレート（1穴に1枚）または培養皿にそっと入れる（1皿に2〜3枚置くことができる）、
3.紫外線ランプからの直射範囲内で20〜30センチのところに2〜3時間照射する、
4.計数した細胞懸濁液を培養プレートに移し、カバーガラス*を培養液に浸す。
5.培養プレートを5%CO 2水浴インキュベーションタンクで37℃で2〜3日間インキュベートし、壁貼り細胞が培養プレートの底部の2／3面積を覆うまで成長した場合、培養プレートを取り出し、カバーピンセットでカバーガラスを軽く取り出し、蒸留水ですすいだ後、急速固定及び免疫細胞化学的検査を行うことができる。
実験の要点と説明：
1.本方法は懸濁細胞培養には適用せず、壁貼り細胞培養に適用し、懸濁細胞は滴下法を使用することができる、
2.使用するカバーガラスは良質なガラスであり、クロム酸洗浄液処理を経なければならない。
3.カバーガラスは非常に薄く、割れやすいので、カバーガラスを取り出す時の動作は軽くしなければならない。
4.より多くの成長状態が一致する細胞が必要な場合は、培養液の浪費を回避し、汚染率を増加させるために、大きな培養皿を使用することができるが、大きすぎることは望ましくない。
5.細胞壁貼付成長能が劣っている場合、カバーガラスを0.5%ポリリジン溶液に5〜10分間浸漬し、自然乾燥することができる。
操作の要点：
1）37℃の水浴釜で培地を予熱する、15 mLの無菌遠心管を用意し、8 mLの予熱培地を加えた。
2）凍結保存細胞を液体窒素タンクから取り出し、37℃の水浴鍋に急速に入れて復温する（清潔なビーカーを用意し、37℃の水を満たし、細胞凍結保存管を取り出した後、迅速にビーカー内に入れ、更に段階的に水浴鍋に移すことができる）。凍結貯蔵管を軽く揺動させ、細胞を1 ~ 2 min以内に*解凍させ、細胞を最も損傷しやすい温度帯（-5 ~ 0℃）にできるだけ早く通過させることができる。凍結保存管の管口は水に入れないことに注意し、BRL（ラット肝細胞）は汚染を避ける。
3）75%アルコールで凍結保存管を拭き取った後、超浄台内に置き、管内細胞を準備した遠心管内に移し、軽く液体を吹き付け、細胞を均一に分散させ、DMSO濃度を下げ、吹き付ける時に気泡の発生を避ける。新鮮な培地で管壁を2回洗浄し、いずれも遠心管内に移した。
4）800 rpmで5分間遠心分離し、上清を捨て、新鮮な培地を加え、細胞懸濁液を吹き付けた。
5）細胞懸濁液をT 25細胞瓶に移し、適量の培地を補充し、細胞瓶を軽く揺らして細胞分布を均一にし、温箱に入れて培養する。
6）翌日に細胞壁付着成長を観察し、新鮮な培地を交換して死細胞を除去した。培養を続け、細胞長が80〜90%になるまで合流すると正常に継代した。一般的に回復したばかりの細胞は2 ~ 3回の継代を経て、細胞の活力が回復してから後続の実験を行うことができる。
アンジオテンシン1変換酵素阻害剤抗体
アンタゴニストアポトーシス転写因子抗体
α-1抗膵
ATP結合蛋白家族6抗体
アデノシン三リン酸結合カセットサブファミリーG 1抗体
リポビン受容体2抗体
ANGEL 1タンパク質抗体
ANGEL 2タンパク質抗体
ANKLE 2タンパク質抗体
精巣特異性アンカーグロブリン1抗体
アンカタンパク質反復ドメインタンパク質13 B抗体
アンカタンパク質反復ドメインタンパク質20 A 1抗体
アンカタンパク質反復ドメインタンパク質20 A 3抗体
アンカタンパク質反復ドメインタンパク質22抗体
アンカタンパク質反復ドメインタンパク質50抗体
BC-020（ヒト乳がん細胞）5×106 cells/ボトル×2
BC-021（ヒト乳がん細胞）5×106 cells/ボトル×2
BC-022（ヒト乳がん細胞）5×106 cells/ボトル×2
BE（2）-M 17（ヒト神経母細胞腫細胞）5×106 cells/ボトル×2
BGC-803（ヒト胃癌細胞）5×106 cells/ボトル×2
C 918（ヒト眼脈絡メラノーマ細胞）5×106 cells/ボトル×2
CAL-27（ヒト舌鱗癌細胞）5×106 cells/ボトル×2
LS 180（ヒト結腸腺癌細胞）5×106 cells/ボトル×2
CNE-2 Z（ヒト鼻咽頭癌細胞）5×106 cells/ボトル×2
MTT検出キットCOLO 201（ヒト結腸直腸腺癌細胞）5×106 cells/ボトル×2
CW-2（ヒト結腸癌細胞）5×106 cells/ボトル×2
CRT（ヒト神経膠腫細胞）5×106 cells/ボトル×2
D 283 Med（ヒト脳髄母細胞腫細胞）5×106 cells/ボトル×2
EA.hy 926（ヒト臍帯静脈細胞融合細胞）5×106 cells/ボトル×2
ECV-304（ヒト臍帯静脈内皮細胞）5×106 cells/ボトル×2
EJ（ヒト膀胱癌細胞）5×106 cells/ボトル×2
H-97（ヒト高転移肝癌細胞）5×106 cells/ボトル×2
