MOC 2細胞系

MOC 2細胞系

MOC細胞系Uppaluri実験室組織培養プログラムの更新2016年12月12日

必要な材料（IMDM MOC線媒体を作製するために必要な試薬は添付のIMDMプロトコルを参照）

Sigma-Aldrich：ジメチルスルホキシド：D 2650-100 ml

FisherScientific：

T 150ボトル：07-200-64

T 75本：10-126-37

冷凍ボトル：03-374-059

45 umフィルタ：09-754-21

05%トリプシン：sh 30236.01

25%トリプシン：sh 30042.01

不活性ライン–MOC 1，22

侵略的なライン——MOC 2

解凍細胞系

1.解凍前T 150にIMDM MOC線培地21 mlを添加する（aT 75に解凍したい場合はT 75に10 mlを添加する）

2.冷凍ボトルを液体窒素から取り出し、70%のアルコール散布バイアルで洗浄した。

3.冷凍ボトルの下半分を37 C水浴に入れ（汚染を避けるために蓋を水に接触させない）、小さな氷が浮遊するまで。

4.冷凍ボトルにエタノールを再度スプレーし、フードに入れた。ピペットを用いて1 mlの培地を1 mlの細胞に移し、2 mlを培地を含むT 150に加えた（1つのT 150で22 ml）。

5.T 150フラスコ中の培地の一部を採取し、凍結フラスコを洗浄し、その平板を放置して、凍結フラスコ中に残っているすべての細胞を確保する。

凍結細胞系：

DMSOは細胞に毒があるので、迅速に動作します

各細胞融合率が70〜80%のT 150フラスコについて、3〜4本のバイアルを凍結した。

1.以下に示すように、T 150から細胞を収穫する

2.テーパチューブ15 ml中で粒子状に回転させる（1000 RPM x 5分）

3.上澄み液を注ぐ

4.細胞を懸濁させるためにテーパーチューブ15 mlを軽く叩く

5.IMDM MOC線培地1.5 mlを加え、培地中で細胞を再構成した氷上保存

6.試験管を氷の上に置く時、1.5 mlの冷凍媒体をゆっくり滴下する

冷凍媒体であるIMDM MOCライン媒体のうち20%のDMSOを作製する。例えば：20 mlの原液に対して、16 mlのIMDM MOC線培地と4 mlのDMSOを添加する。.45 umフィルタを使用したシリンジフィルタ

7.冷凍ボトル3本に1 mlを等分して入れる

8.−80℃で2週間以内保存する。

9.1〜2週間以内に液体窒素中に入れる。

注：必要に応じてIMDM 2 mlと冷凍媒体2 mlに追加し、4つのバイアルに保存することができます。また、細胞を凍結する前に、細胞を計数し、バイアルに記録することが好ましい。

MOC 2細胞系

細胞系特徴：

不活性-MOC 1：体内研究に基づき、攻撃性は低い。80%集水域T 150から1：12を通過する場合、80%集水域に達するには2〜4日かかる。MOC 1細胞系は、より攻撃的な細胞系よりも収穫時にフラスコから取り出す時間が長い。

攻撃性-MOC 2：体内研究に基づいて、より攻撃性がある。集水域の80%から1:12の割合で通過する場合

T 150は、80%の合流には2 ~ 4日かかります。侵襲性細胞系は不活性細胞系よりフラスコから脱落しやすい。

T 150から細胞を収穫し、伝達し、80%融合：

1.T 150の媒体を注ぎ瓶に注ぐ

2.10−20 mlのPBSで1回洗浄する。PBS洗浄液を注ぎ出す。

3.0.05%トリプシン1.5 mlを添加し、先端フラスコはトリプシンが表面積全体をカバーすることを確保し、それによってすべての細胞に接触し（迅速に行うことで、細胞がトリプシンに長時間曝されないようにする）、トリプシンを注出し、その後再び1.5 ml 0.25%トリプシンを添加する。

4.37℃の恒温タンクに入れる。侵襲性細胞株については、3〜4分間インキュベートし、不活性細胞株については10〜12分間かかることがあるが、6〜8分後に検査した。

5.フラスコの側面をわざと手のひらで数回軽くたたいて細胞を緩める

6.細胞が培地中で自由に浮遊しているかどうかを顕微鏡下で検査する。ほとんどない場合は、37℃の孵化器に3〜5分間戻します。細胞が細胞を殺すので、できるだけトリプシン中に長く留まらないようにしてください。

7.すべてまたはほとんどの細胞が浮遊したら、10 mlのIMDM MOC線培地を添加して反応を中和する。

8.ピペットを用いて培地と細胞をフラスコから15 mlコーンフラスコに移し、細胞を沈殿させた。1000 RPM xで5分間遠心分離した。

9.上澄み液を注ぎ出す。

10.細胞を1：12の割合で渡す−細胞を別の12 ml培地に再懸濁させる。

11.そこから1 mlを取り出し、総体積22 mlのIMDM MOC線培地（1：12希釈）の新しいT 150フラスコに入れる

12.37℃の孵化器に戻して成長させる。2〜4日以内に80%の合流を達成しなければならない。

マウス脇腹注射（異位）：

必要な細胞濃度：

MOC 1、MOC 22：（0.15 mlに1 e 6細胞を注射する）=6.66 e 6細胞/ml

1.上述のように0.25%トリプシンを用いて細胞を収穫する。

2.IMDM MOC線培地でトリプシンを中和した後、細胞を50 mlテーパ粒子に回転させた（1000 RPM x 5分）。（注意：50 mlテーパを用いて、小規格針から細胞を抽出させる

注射を打つ。

3.細胞沈殿物を10 mlの冷たいPBS中に再懸濁させて細胞を洗浄する（FCSを含む培地をできるだけ多く除去することを確保する）ことにより、再び細胞を沈殿物に回転させる（1000 RPM x 5分）

4.細胞沈殿物を3〜6 mlの冷たいPBSに再懸濁させて細胞を再洗浄する（この体積を使用して細胞を計数するので、沈殿物の大きさによって体積が決まる）

5.血球カウンタまたは自動細胞カウンタを用いて細胞/mlを計数し、デロイトブルーを用いて

死細胞を除去する。存在する細胞総数（細胞/mlx PBS総ml）を用いて、6.66 e 6（MOC 1、MOC 22）または6.66 e 5細胞/ml（MOC 2）濃度に達するために必要な体積で懸濁細胞粒子を計算した。

例えば、MOC 1の場合、細胞カウントは、2.8 e 6細胞/ml x 5 ml（PBS）＝合計14 e 6細胞である。14 e 6細胞/6.66 e 6細胞/ml=2.1 ml PBS、懸濁細胞沈殿用。

6.細胞を再び粒子に回転させる。PBS上清液を注液する（ピペットを用いて吸引しない）。粒子を適切な濃度になるように計算体積の氷冷PBSに再懸濁する

濃縮後、上澄み液を注ぐと、50 mlのコーンボトルに約200 ulが残ることを覚えておいてください。

7.マウス1匹に0.15 ml（150 ul）細胞を皮下注射して、50 mlテーパーを氷に移した。

8.標準方案に従ってマウスに注射する。1 mlの注射器を使用しています。1.5インチ21番針を用いて細胞を抽出し、針を189インチ26番針に切り替えて注射した。

1 Lメディアプロトコル