一、ELISAの原理

ELISAの基礎は抗原または抗体の固相化および抗原または抗体の酵素標識である。固相担体表面に結合された抗原または抗体は依然として免疫学的活性を維持し、酵素標識された抗原または抗体は免疫学的活性を保持するとともに、酵素活性を保持する。測定時、被検検体（その中の抗体または抗原を測定する）は固相担体表面の抗原または抗体と反応する。固相担体上に形成された抗原抗体複合体を液体中の他の物質から洗浄方法で分離する。さらに酵素標識抗原または抗体を加え、反応によって固相担体に結合する。このとき固相上の酵素量は標本中の被検物質の量に一定の割合を示した。酵素反応の基質を添加すると、基質は酵素によって触媒されて有色生成物となり、生成物の量は標本中の被検物質の量と直接相関するため、呈色の濃淡に基づいて定性または定量分析を行うことができる。酵素の触媒効率が高いため、間接的に免疫反応の結果を増幅し、測定方法を高い感度にした。

二、ELISAのタイプ

ELISAは抗原を測定するために用いられてもよく、抗体を測定するために用いられてもよい。この測定方法には、（1）固相の抗生物質原または抗体、すなわち「免疫吸着剤」（immunosorbent）、（2）酵素標識抗原または抗体、「結合体」（conjugate）と称する、（3）酵素反応の基質。試薬の供給源と標本の状況及び検出の具体的な条件に基づいて、様々な異なるタイプの検出方法を設計することができる。臨床検査に用いられるELISAには主に以下のような種類がある：

1.二抗体サンドイッチ法による抗原測定

二抗体サンドイッチ法は抗原zuiを検出するための一般的な方法であり、操作手順は以下の通りである：

1）特異的抗体と固相担体を結合し、固相抗体を形成する。洗浄により未結合抗体及び不純物を除去した。

2）被検検体を加え、保温反応する。標本中の抗原は固相抗体と結合し、固相抗原抗体複合体を形成した。洗浄により他の未結合物質を除去した。

3）酵素標的抗体、保温反応。固相免疫複合体上の抗原は酵素標的抗体と結合する。*未結合酵素標準抗体を洗浄する。このときの固相担体に含まれる酵素量は、検体中の被検抗原の量と相関する。

4）基質添加による発色。固相上の酵素触媒基質は有色生成物となる。標本中の抗原の量を比色により測定した。

臨床検査において、この方法は各種蛋白質などの高分子抗原、例えばHBsAg、HBeAg、AFP、hCGなどを検査するのに適している。被検抗原に対する異性体抗体が得られれば、被固相ベクターをカプセル化し、酵素結合体を調製するためにこの方法を確立することができる。例えば、抗体の源は抗血清であり、包被と酵素標的用の抗体はそれぞれ異なる属の動物から取った。モノクローナル抗体を使用する場合、抗原上の異なる決定クラスタに対する2つの単抗を選択し、それぞれ固相担体を被覆し、酵素結合体を製造するために使用する。この二重部位サンドイッチ法は非常に高い特異性を持ち、しかも被検検体と酵素標識抗体を一緒に保温反応させ、一歩検査することができる。一段階法による測定では、標本中の被検抗原の含有量が高い場合、過剰抗原はそれぞれ固相抗体及び酵素標的抗体と結合し、「サンドイッチ複合体」は形成されない。沈殿反応における抗原過剰の後帯域現象と同様であり、このとき反応後に発色する吸光値（抗原過剰帯域上に位置する）は標準曲線（抗体過剰帯域上に位置する）のある抗原濃度の吸光値と同じであり、常法で測定すると、得られた結果は実際の含有量よりも低くなり、この現象は鉤状効果（hookeffect）と呼ばれ、標準曲線がピークに達すると鉤状弯落するためである。フック効果が深刻な場合、反応は色を出さずに偽陰性結果を出すこともできる。したがって、一段階試薬を用いて標本中の含有量が異常に高くなる物質（例えば血清中のHBsAg、AFP、尿hCGなど）を測定する場合、測定可能範囲のzuiの高い値に注意しなければならない。このような試薬を高親和性モノクローナル抗体を用いて調製することは、鉤状効果を弱めることができる。HBsAgのa決定クラスタなど、測定された分子の異なる部位に同じ決定クラスタが複数含まれているとしても、この決定に対する同一の単抗はそれぞれ被固相と酵素結合物を包含することができる。しかし、HBsAgの検出においてはサブタイプの問題に注意すべきであり、HBs Agにはadr、adw、ayr、aywの4つのサブタイプがあり、各サブタイプには同じa決定クラスタの反応性があるが、これも単抗を用いたサンドイッチ法で注意すべき問題である。二抗体サンドイッチ法による抗原測定の別の注意点は、リウマチ因子（RF）の干渉である。RFは自己抗体であり、多くはIgM型であり、多くの動物IgGのFcセグメントと結合することができる。二重抗体サンドイッチ法として用いられた血清標本には、抗原成分として働きながら、固相抗体と酵素標識抗体と結合して偽陽性反応を示すRFが含まれている。F（ab'）またはFab断片を酵素結合物として用いた試薬は、Fcセグメントが除去されるため、RFの干渉が除去される。二抗体サンドイッチ法ELISA試薬がRFの影響を受けているかどうかは、このような試薬の審査指標の一つとされている。二抗体サンドイッチ法は二価または二価以上の高分子抗原を測定するのに適しているが、半抗原および小分子単価抗原を測定するのには適しておらず、二位点サンドイッチを形成することができないためである。

2.二抗原サンドイッチ法による抗体測定

反応モードは二重抗体サンドイッチ法と類似している。特異的抗原で被覆し、酵素結合体を調製して、対応する抗体を検出した。間接法による抗体測定との違いは、酵素標的抗原を酵素標的抗体に置き換えることである。この方法では、被検検体は希釈する必要はなく、直接測定に用いることができるので、その感度は間接法より相対的に高い。B型肝炎マーカー中の抗HBsの検出は常に本法を採用している。本法の鍵は酵素標準抗原の製造にあり、抗原構造の違いに基づいて、適切な標識方法を探すべきである。

3.間接法による抗体測定

間接法は抗体を検出するための一般的な方法である。その原理は酵素標識抗抗体（抗ヒト免疫グロブリン抗体）を用いて固相抗原と結合する被検抗体を検出するため、間接法と呼ばれる（図2-3参照）。操作手順は次のとおりです。

1）特異的抗原と固相担体を結合し、固相抗原を形成する。洗浄により未結合抗原及び不純物を除去する。

2）希釈された被検血清を加え、保温反応を行う。血清中の特異抗体は固相抗原と結合し、固相抗原抗体複合体を形成する。洗浄後、固相担体には特異的抗体のみが残され、血清中の他の成分は洗浄中に洗浄された。

3）酵素添加標準抗抗体。酵素標準抗ヒトIgを用いて総抗体を検出することができるが、一般的には酵素標準抗ヒトIgGを用いてIgG抗体を検出することが多い。固相免疫複合体中の抗体は酵素標識抗体抗体と結合し、それによって間接的に酵素を標識する。洗浄後、固相担体上の酵素量は標本中の被検抗体の量と正相関していた。

4）基質添加発色本法は主に病原体抗体の検出に用いられ、伝染病の診断を行う。

間接法の利点は、変換パケットが抗原であれば、同じ酵素標準抗抗体を用いて対応する抗体を検出する方法を確立することができることである。間接法の成功の鍵は抗原の純度にある。粗抽出抗原被覆を用いても実際に有効な結果が得られる場合があるが、できるだけ精製して試験の特異性を高めるべきである。特に、E.Coliをエンジニアリング酵素とする組換え抗原など、一般的な健常者血清と反応する不純物の除去に注意しなければならない。E.Coli成分が含まれているなど、E.Coli感染者の血中の抗E.Coli抗体と反応する可能性が高い。抗原には酵素標的抗ヒトIgと反応する物質も含まれてはならず、例えばヒト血漿やヒト組織由来の抗原、例えばその中のIgを除去しないと、試験中に偽陽性反応が発生することもある。また、抗原に無関係なタンパク質が含まれている場合は、競合吸着により包被効果に影響を与えることもあります。間接法における別の妨害因子は、正常血清中に含まれる高濃度の非特異性である。患者の血清中に検査された特異的なIgGは総IgGのほんの一部を占めている。IgGは吸着性が強く、非特異IgGは固相担体に直接吸着することができ、場合によっては被覆抗原の表面に吸着することもできる。したがって間接法では、抗原カプセルは、固相上の空きギャップを閉鎖するために、通常、無関係タンパク質（例えばウシ血清タンパク質）で再カプセル化される。また、検査中に標本を先に希釈し（1：40〜1：200）、高すぎる陰性本底影響結果の判断を避ける。

4.競争法による抗体測定

抗原材料中の干渉物質が除去しにくい場合、または十分な精製抗原が得られにくい場合、この方法で特異的抗体を検出することができる。その原理は標本中の抗体と一定量の酵素標識抗体が固相抗原と結合することを競争することである。標本中の抗体量が多いほど、固相に結合する酵素標識抗体は少なくなるため、陽性反応は陰性反応より色が浅い。抗原が高純度であれば、固相で直接被覆することができる。抗原中に妨害物質がある場合、直接被覆することは容易ではなく、捕獲被覆法、すなわち固相抗原に対応する抗体を先に被覆し、その後抗原を添加して固相抗原を形成することができる。抗原中の不純物を洗浄除去した後、標本と酵素標識抗体を加えて競争結合反応を行った。競争法による抗体測定には多種のパターンがあり、標本と酵素標識抗体を固相抗原と競争結合することができ、抗HBc ELISAは一般的にこの方法を採用する。もう1つのモードは、標本を抗原とともに固相抗体に加えて競争結合し、洗浄後に酵素標識抗体を加え、固相に結合した抗原と反応する。HBeに対する検出は一般的にこの方法を採用している。

5.競争法による抗原測定

小分子抗原または半抗原の原因はサンドイッチ法とすることができる2つ以上の部位が不足しているため、二抗体サンドイッチ法で測定することはできず、競争法モデルを採用することができる。その原理は標本中の抗原と一定量の酵素標的抗原が競合して固相抗体と結合することである。標本中の抗原量の含有量が多いほど、固相に結合する酵素標的抗原は少なくなり、zui後の発色も浅くなった。小分子ホルモン、薬物などのELISA測定にはこの方法が多用される。

6.捕捉パケット法による抗体測定

IgM抗体の検出は感染症の早期診断に用いられる。間接法ELISAは一般的に総抗体またはIgG抗体の検出にのみ適用される。抗原被覆の間接法を用いて直接IgM抗体を測定すると、標本中には一般的に高濃度のIgG抗体が同時に存在するため、後者は固相抗原を競争的に結合し、一部のIgM抗体を固相に結合することができない。したがって、抗ヒトIgMを二次抗体として用い、間接的にIgM抗体を測定する場合は、まず標本をAタンパク質または抗IgG抗体で処理して、IgGの干渉を除去しなければならない。臨床検査で抗体IgMを測定する際には捕捉被覆法が用いられることが多い。まず抗ヒトIgM抗体で固相を被覆し、血清標本中のIgM（抗原に対する特異的IgM抗体及び非特異的IgMを含む）を捕捉した。次に抗原を加え、この抗原は特異的なIgMとのみ結合する。次いで、抗原に対する特異的抗体を酵素標識する。さらに基質作用、呈色は標本中のIgMと正の相関を持つ。この方法はウイルス性感染の早期診断によく用いられる。A型肝炎ウイルス（HAV）抗体の検出パターンは図2−7を参照。リウマチ因子（RF）は同様に捕捉パケットを妨害してIgM抗体を測定することができ、偽陽性反応を引き起こす。そのため、IgGを中和する間接法は最近人気があり、このような試薬を用いて抗CMV IgGMと抗トキソプラズマIgM抗体を検出することに成功した。

7.ABS-ELISA法

ABSは、アビジン（avidin）ビオチン（biotin）システム（system）の略語である。親和素は糖蛋白であり、分子量は60000であり、各分子はビオチンと結合できる4つのサブユニットから構成されている。ビオチンは小分子化合物であり、分子量244である。化学的方法で製造された誘導体−ヒドロキシコハク酸イミドエステルは、タンパク質や糖などの様々なタイプの大きさの分子とビオチン標識生成物を形成することができ、標識方法は非常に簡便である。ビオチンと親和素の結合は強い特異性を持ち、その親和性は抗原抗体反応よりずっと大きく、両者は結合すると極めて安定している。1つの親和素は4つのビオチン分子と結合できるため、例えばABSとELISA法を酵素標識親和素-ビオチン（LAB）法と架橋親和素-ビオチン（ABC）法の2種類に分けることができる。両方とも、旧ELISA系における酵素標的抗体（抗原）をビオチン標識抗体（または抗原）で置換する。LABでは、固相ビオチンはまず標識されていない親和素と反応し、それから酵素標識ビオチンを加えて感度をさらに高める。初期には、親和性元素は卵白から抽出され、このような卵親和性元素は塩基性糖蛋白質であり、ポリスチレン担体との吸着性が強く、ELISAに用いると本底を高くすることができる。ストレプトカビから抽出されたストレプトマイシンにはこの欠点はなく、ELISA応用において前者に代わる傾向がある。ABS-ELISAは通常のELISAより2種類の試薬を多用したため、操作手順が増加し、臨床検査においてABS-ELISAの応用は多くない。