ヒト食道癌組織源線維芽細胞の分離と培養を完了した後、細胞の鑑定と機能分析をさらに行い、その生物学的特性が実験要求に合致することを確保する必要がある。次に、次の重要な操作手順を示します。

1.細胞形態学的観察

-細胞の形態を定期的に観察するために、倒置顕微鏡を使用する。初代線維芽細胞は通常、紡錘形または多角形を呈し、壁に貼り付けて成長し、細胞質の伸びが良好である。円形浮遊細胞や異常凝集が発生すると、汚染や細胞の状態が悪いことが示唆される可能性があり、培養条件を見直す必要がある。

2.免疫蛍光同定

−Vimentin、α−SMAなどの特異的マーカーによる免疫蛍光染色。線維芽細胞はVimentinを高発現すべきであり、α−SMA陽性率はその活性化の程度を反映することができる。同型対照を設定して非特異的結合を排除することに注意してください。

3.機能検証実験

−増殖能測定：CCK−8またはEdU法を用いて細胞増殖活性を評価し、癌傍と癌源線維芽細胞の差異を比較する。

−コラーゲン分泌分析：ELISAまたはWestern BlotによりI/III型コラーゲン分泌レベルを測定し、その線維化促進能力を明らかにした。

−共培養実験：線維芽細胞と食道癌細胞系（KYSE−150など）を共培養し、癌細胞の侵襲移動に対する影響（Transwell実験など）を観察する。

4.凍結保存と回復

−対数成長期細胞を選択し、10%DMSOを含む凍結保存液を凍結保存管に分注し、プログラム的に冷却した後、液体窒素に転入した。回復時に急速に水浴が溶け、遠心分離して凍結貯留液を除去し、高濃度血清培地で再懸濁し、24時間後に液交換した。

注意事項

-マイコプラズマ汚染を回避するために、厳密な無菌操作、

-初代細胞の継代回数は5代を超えないことを提案し、表現型のドリフトを防ぐため、

-機能実験を3回以上繰り返してデータの信頼性を確保する必要があります。